簡要描述:磷酸化組蛋白 H3 (Ser10) 檢測能夠檢測組蛋白 H3 尾部的 Ser10 磷酸化,組蛋白 H3 是基因表達和有絲分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Ser10 的磷酸化與有絲分裂和減數(shù)分裂期間的染色體濃縮密切相關(guān)。cisbio 磷酸組蛋白 H3 (Ser10) 細胞試劑盒
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cisbio 磷酸組蛋白 H3 (Ser10) 細胞試劑盒
cisbio 磷酸組蛋白 H3 (Ser10) 細胞試劑盒
概述:磷酸化組蛋白 H3 (Ser10) 檢測能夠檢測組蛋白 H3 尾部的 Ser10 磷酸化,組蛋白 H3 是基因表達和有絲分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Ser10 的磷酸化與有絲分裂和減數(shù)分裂期間的染色體濃縮密切相關(guān)。
磷酸化組蛋白 H3 (Ser10) 檢測可測量在 Ser10 位點磷酸化的組蛋白 H3。與 Western Blot 不同,該檢測基于平板,不需要凝膠、電泳或轉(zhuǎn)移。磷酸組蛋白 H3 (Ser10) 檢測使用 2 種標(biāo)記抗體:一種帶有供體熒光團,另一種帶有受體。選擇第一種抗體是因為它能特異性結(jié)合蛋白質(zhì)上的磷酸化基序,第二種是因為它能夠獨立于蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)識別蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)磷酸化能夠形成涉及標(biāo)記抗體的免疫復(fù)合物,并使供體熒光團靠近受體,從而產(chǎn)生 FRET 信號。
2 板協(xié)議涉及在裂解前在 96 孔板中培養(yǎng)細胞,然后將裂解物轉(zhuǎn)移到 384 孔低體積檢測板,然后添加磷酸組蛋白 H3 (Ser10) HTRF 檢測試劑。該協(xié)議使細胞的生存能力和匯合度得到監(jiān)測。
使用 HTRF 試劑檢測磷酸化組蛋白 H3 (Ser10) 可以在用于培養(yǎng)、刺激和裂解的單個板中進行。無需洗滌步驟。這種 HTS 設(shè)計的協(xié)議可實現(xiàn)小型化,同時保持穩(wěn)健的 HTRF 質(zhì)量。
將指數(shù)生長的 Hela 細胞培養(yǎng)至 80% 匯合度,并用諾考達唑處理 16 小時。培養(yǎng)基去除和裂解后,通過離心收集可溶性上清液。等量的裂解物用于 WB 和 HTRF 的并排比較。HTRF 檢測的靈敏度是 Western Blot 的 25 倍。使用 HTRF 磷酸組蛋白 H3 (Ser10),僅 256 個細胞就足以進行最小信號檢測,而 Western Blot 信號則需要 6,400 個細胞。HTRF 檢測的靈敏度是 Western Blot 的 25 倍。
將 Hela 和 A431 細胞接種在 96 孔板中,并用 Nocodazole 處理 16 小時,Nocodazole 是一種抗有絲分裂劑,可解聚微管并在組蛋白 H3 Ser10 磷酸化達到最大時阻斷細胞有絲分裂。去除細胞培養(yǎng)基后,加入 50 µl、100 µl 或 200 µl 裂解緩沖液孵育 30 分鐘。將 16 µl 的每種裂解物轉(zhuǎn)移到 384sv 白板上進行 HTRF 分析。將裂解體積增加至 200µl 可改善 HTRF 檢測信號的線性度。
總體組蛋白磷酸化在細胞周期期間波動非常顯著,其特征在于有絲分裂中絲氨酸 10 上組蛋白 H3 磷酸化的峰值。極光激酶 B 直接負責(zé)有絲分裂組蛋白 H3 Ser10 磷酸化。與 BORA 復(fù)合的 Aurora 激酶 A 負責(zé)在 G2 期初始激活 PLK1,導(dǎo)致在 G2/M 轉(zhuǎn)換檢查點激活細胞周期蛋白依賴性激酶 1 有絲分裂進入。極光激酶 A 在人類癌癥中經(jīng)常被擴增,極光激酶 A 在人類腫瘤中的過度表達與不良預(yù)后和基因組不穩(wěn)定相關(guān)。此外,極光激酶 B 的高表達水平與膠質(zhì)母細胞瘤、卵巢癌和肝細胞癌的不良預(yù)后相關(guān)。
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